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ARTÍCULO ORIGINAL
Efectos
citotóxicos de gluconato de clorhexidina en células epiteliales.
Cytotoxic
effect of chlorhexidine gluconate on epithelial cells.
Claudio
Cabral-Romero1, René Hernández-Delgadillo2
1 Profesor
investigador, Facultad de Odontología, Universidad Autónoma de
Nuevo León, UANL, Monterrey, Nuevo León, México
2 Profesor investigador, Facultad de Odontología, Universidad Autónoma
de Nuevo León, UANL, Monterrey, Nuevo León, México.
Resumen
La necesidad de nuevos agentes antimicrobianos seguros y eficaces, constituyen
una prioridad a nivel mundial como alternativas tanto en la prevención,
así como en el tratamiento de enfermedades infecciosas debido al incremento
de patógenos multiresistentes. La clorhexidina (CHX) ha sido ampliamente
utilizada como agente antiséptico en medicina y odontología,
con una excelente efectividad.
El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la citotoxicidad de la CHX
sobre cultivo de la línea celular HeLa. El efecto citotóxico
de la CHX fue determinada mediante el ensayo de viabilidad celular MTT. El
daño al ADN genómico de las células fue evaluado por
el ensayo del cometa, y finalmente para detectar apoptosis se determinó
mediante el ensayo de Anexina V. Nuestros resultados mostraron un 0.72% de
células viables, representando una toxicidad severa a 1 minuto de exposición
por CHX. El ensayo del cometa fue positivo a CHX, dañando el ADN de
células HeLa y mostrando la estela clásica de un cometa al mismo
tiempo que el control positivo de daño al ADN (Etopósido, ETO).
Finalmente, se detectó que la CHX puede llevar a la destrucción
de la célula. En conclusión, la clorhexidina es un excelente
antiséptico sin embargo, con la incapacidad de excluir a las células
de mamífero lo que puede llegar a la pérdida de las mismas teniendo
consecuencias importantes en la curación.
Palabras clave: Clorhexidina (CHX), Citotoxicidad, Genotoxicidad, Apoptosis.
Abstract
The requirement for new safe and effective antimicrobial agents is a priority worldwide as alternatives both in prevention and in the treatment of infectious diseases due to the increase of multi-resistant pathogens. Chlorhexidine (CHX) has been widely used as an antiseptic agent in medicine and dentistry, with excellent effectiveness.
This work aimed to evaluate the cytotoxicity of CHX on culture of HeLa cell line. The cytotoxic effect of CHX was determined by the MTT cell viability assay. Genomic damage DNA cells was assessed by the comet assay and finally to detect apoptosis was determined by Annexin V assay. Our results showed 0.72% of viable cells, representing a severe toxicity 1 minute CHX exposure. The comet assay was positive to CHX, damaging the DNA of HeLa cells and showing the classic trail of a comet while the positive control DNA damage (Etoposide, ETO). Finally, it was found that the CHX can lead to cell destruction. In conclusion, it is an excellent antiseptic chlorhexidine however, with the failure to exclude mammalian cells which can reach the destruction of these have important implications on healing.
Keywords: Chlorhexidine, Citotoxicity, Genotoxicity, Apoptosis.
INTRODUCCIÓN
La clorhexidina (CHX) es considerada una sustancia antimicrobiana ampliamente
utilizada en el área médica y con mayor énfasis en la odontología.
Desde 1960 cuando Schroeder reportó propiedades antiplaca de la clorhexidina1
hasta la actualidad, la clorhexidina ha sido abundantemente reportada en numerosos
estudios con la propiedad de “gold standard” en prácticas o
experimentos in vitro, utilizada como un control positivo de inhibición
de crecimiento microbiano2-4 y también empleado en estudios
o ensayos clínicos5-7. Desafortunadamente, las cualidades
perjudiciales de la clorhexidina no son particularmente sobre las bacterias
ya que es nociva para células de mamífero incluyendo fibroblastos
gingivales8, odontoblastos9, macrófagos10.
Los colutorios orales en la actualidad contienen ingredientes activos y que
en su estructura química tienen la capacidad de inhibir el crecimiento
microbiano e incluso han demostrado eliminar a los biofilms11; sin
embargo, existe poca documentación disponible sobre su toxicidad celular
y genética12. El propósito de este estudio fue investigar
los efectos nocivos de la clorhexidina en células epiteliales HeLa mediante
el ensayo de viabilidad celular MTT, posteriormente analizar el posible daño
al ADN genómico empleando el ensayo del cometa y finalmente evaluar si
la clorhexidina induce a apoptosis mediante Anexina V.
MATERIAL Y MÉTODOS
Ensayo de viabilidad celular basado en la reducción de MTT en células
epiteliales.
Para realizar el ensayo de viabilidad celular basado en la reducción
de MTT, que consiste en la reducción metabólica del Bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa que transforma como resultado, de color
azul-morado (formazan), que permite determinar la funcionabilidad mitocondrial
de las células tratadas.
Primero, cultivamos 1x105 células HeLa (ATCC CCL-2) en medio
mínimo esencial (MME) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%,
respectivamente se incubó (SFB, Biowest, Nuaille, France) a una temperatura
de 37°C al 5% de CO2 utilizando placas de 96 pozos de
poliestireno (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) por 24 horas para obtener una
monocapa confluente13. Posteriormente, fue retirado el MME y reemplazado
con nuevo MME y agregando a un grupo CHX a una concentración de 1200
µM (Ultradent products, South Jordan, UT). Durante el experimento, se evaluaron
diferentes tiempos (0, 5, 10, 15, 30 y 1440 minutos), y finalmente fue añadido
10 µL de MTT (Biotium, Hayward, CA) 14,15 por pozo por cada 100 µL
de MME. Después, fue incubado por 2 horas a 37°C and
5% of CO2 y posteriormente fue retirado el MME y se agregaron 100
µl de dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver los productos de formazán,
resultado de la reducción de MTT. El MTT reducido fue cuantificado a
una longitud de onda de 570nm utilizando una lectora de placas de ELISA (Biotek,
Winooski, VT). La cantidad de formazán producido es proporcional al número
de células vivas. Los experimentos fueron realizados por triplicado y
analizados mediante estadística descriptiva.
Evaluación del daño al ADN genómico de la clorhexidina
mediante el ensayo del cometa.
Para determinar la posibilidad de daño al ADN de las células
después de exponerlas a la CHX, empleamos el ensayo del cometa (Oxiselect,
Comet assay, Cell Biolabs, Inc, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Primero, las células HeLa fueron incubadas a 37°C con una atmósfera
de 5% de CO2 por 18 horas; un grupo de células fue tratado
con clorhexidina a una concentración de 1200 µM mientras que el
grupo control positivo fue Etoposido (ETO) a una concentración de 100
µM. Como control negativo, células con MME sin ningún tratamiento.
Después de la incubación las células fueron colectadas
por centrifugación a 700 RPM por 2 minutos y fue descartado el sobrenadante.
A continuación, las células fueron lavadas con BFS (Buffer fosfato
salino) y se combinó agarosa de baja fusión en una relación
1:10 y pipeteamos con 75 uL/pozo dentro de la laminilla (Oxiselect Comet Slide).
La laminilla fue mantenida horizontalmente y se colocó en 25 mL de un
amortiguador de lisis y fue incubado por 30 minutos a 4°C en la obscuridad.
El amortiguador de lisis fue reemplazado con 25 mL de solución alcalina
y fue incubado nuevamente por 30 minutos a 4°C en la obscuridad. Posteriormente,
la laminilla se colocó en una cámara de electroforesis horizontal
aplicando una corriente de 30 volts por 30 minutos. Después, la laminilla
sé lavó con agua estéril y fue reemplazada con etanol frío
al 70% por 5 minutos. El etanol fue removido y la laminilla se dejó secar
a temperatura ambiente. Una vez que la agarosa y la laminilla estaban completamente
secos, añadimos 100 µL/pozo del marcador fluorescente (Vista Green
Dye, Oxiselect) y se incubó a una temperatura ambiente por 15 minutos.
Finalmente, utilizamos un microscopio de fluorescencia para la toma de micrografías
usando el filtro FITC (492 nm).
Induccion de apoptosis de la clorhexidina en celulas epiteliales.
Para analizar si CHX podría conducir a la apoptosis despues del periodo
de incubación, fueron empleados marcadores específicos (CFTM488A/7-AAD,
Apoptosis Assay kit, Biotium, Hayward, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante16.
Las células estuvieron en contacto con CHX durante su crecimiento a 1200
µM. Como control positivo de apoptosis, ETO a 100 µM y finalmente
células sin tratamiento. Después de 24 horas, las células
fueron removidas y lavadas con solución de fosfato salino (PBS). Consecutivamente,
las células fueron resuspendidas en solución de unión al
1X y se hicieron alícuotas de 100 µL por tubo. Después, fueron
agregadas las soluciones de trabajo (5 µl de CF488A-Annexin V y 2 µl
de 7-AAD) a las células y se incubaron por 30 minutos en la obscuridad.
Finalmente, se evaluaron los resultados utilizando microscopía de fluorescencia
(Olympus IX70, Miami, EUA).
RESULTADOS
EvaluaciÓn de la citotoxicidad de la CHX en células epiteliales.
Para determinar la citotoxicidad, fue expuesta la CHX a diferentes tiempos
utilizando una sola concentración (1200 µM equivalente a 0.12%)
que es la más utilizada en colutorios orales. El número de células
vivas fue determinado mediante el ensayo de viabilidad celular MTT y los resultados
indicaron que el 99.28% de las células no sobrevivieron a la exposición
de la clorhexidina a los 5, 10, 15, 30 y 1440 minutos, impidiendo completamente
su crecimiento y división celular, exhibiendo su alto efecto citotóxico
sobre nuestros experimentos con células epiteliales HeLa (Figura 1).
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Figura
1. Ensayo de viabilidad celular MTT de la CHX sobre células epiteliales
HeLa a diferentes tiempos de exposición. |
Efecto de la CHX en el ADN genómico sobre células epiteliales.
El posible daño al ADN genómico por la CHX fue determinado mediante
el ensayo del cometa mediante microscopía de fluorescencia. Se pudo observar
que después de la incubación con CHX y ETO, ambos presentaron
la estela clásica de un cometa, indicando su ADN dañado en comparación
con células sin ningún tratamiento lo que sugiere la ausencia
de efectos tóxicos sobre el ADN en nuestras condiciones experimentales.
Basándose en estos resultados, la CHX a una concentración de 1200
µM por 24 horas, tiene un daño importante, afectando el ADN de células
HeLa (Figura 2).
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Figura
2. Determinación de genotoxicidad de la CHX mediante el ensayo
del cometa.
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Detección de apoptosis en el crecimiento de células HeLa con
la CHX mediante microscopia de fluorescencia.
Para corroborar si la CHX podria inducir a la apoptosis de las células,
se empleó el ensayo de Anexina V mediante microscopía de fluorescencia.
Los resultados indicaron que la CHX en la concentración de 1200 µM
promueve la apoptosis de las células HeLa (Figura 3). El conjugado fluorescente
de Anexina V interactúa con fosfatidilserina expuesta por las células
y lo observamos claramente por microscopía de fluorescencia (Figura 3).
No obstante, el marcador utilizado 7-AAD (7-aminoactinomicina D) que tiene una
gran afinidad por el ADN especialmente en regiones ricas en GC. En la Figura
3 podemos ver que este marcador, en células dañadas puede atravesar
la membrana citoplasmática, de lo contrario ocurre lo opuesto, observamos
un claro estado necrótico en ambos casos (CHX y ETO).
Estos resultados sugieren que la concentración de CHX y ETO, inhiben
el crecimiento de las células HeLa mediante la alteración de las
funciones básicas y promoción de apoptosis.
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Figura
3. Análisis de la detección de apoptosis inducida por CHX
en células epiteliales HeLa mediante anexina V.
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DISCUSIÓN
Una de las características que posee la CHX es su gran potencial no selectivo
antimicrobiano de la microbiota oral; sin embargo llega a afectar a las células
mamíferas8. De hecho, a muy bajas concentraciones es tóxico
en una variedad importante de células eucariotas9, 17 y también
al sistema inmune10, 18. En nuestro trabajo encontramos que la CHX
al 0.12%, dañó completamente la monocapa de células HeLa
a los 5 minutos de exposición basado en el ensayo de viabilidad celular
MTT, resultado similar a lo encontrado en el ensayo con células odontoblásticas
(MDPC-23)9. Existen numerosos informes sobre su seguridad como un
enjuague oral, pero sus efectos sobre la curación de heridas han sido
contradictorios. En un estudio in vitro con fibroblastos humanos, las células
que se expusieron a la CHX al 0.12% durante 30 segundos, apoyan la hipótesis
de que la CHX es altamente citotóxico para las células in vitro
y debido esto, diversas funciones celulares tales como la proliferación
y la síntesis de proteínas se ven afectados en diferentes grados
por la droga19. Los efectos de la CHX fueron evaluados por Chang
y colaboradores sobre células humanas de ligamento periodontal (PDL)
inhibiendo la síntesis de proteínas20. El mecanismo
intrínseco citotóxico de la CHX sobre células eucariotas
es, sin embargo, todavía desconocido. Se ha propuesto que la CHX inhibe
la actividad mitocondrial; síntesis de proteínas y ADN, así
como afectando la proliferación celular, finalmente causando la muerte
celular por el agotamiento de ATP20-22. Nuestros resultados demostraron
que la CHX al 0.12% posee una toxicidad severa incluso, en el menor tiempo de
exposición (1 minuto) lo que nos lleva a buscar nuevas alternativas de
tratamiento, que sean seguras y sin ningún efecto nocivo a los tejidos
orales.
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Autor de correspondencia:
René Hernández Delgadillo.
rene.hdz.d@gmail.com
Artículo recibido:
2 de Febrero de 2016.
Artículo aprobado para publicación:
26 de Abril de 2016.
Revista Mexicana
de Estomatología.
Vol 3, No
1 Enero - Junio 2016.
ISSN: 2007-9052
www.remexesto.com
ISSN: 2007-9052
Http:www.remexesto.com
